نوطة العملي. عملي الكيمياء الحيوية Biochemistry Lab

Transcript

1 230 عملي 76 نوطة العملي عملي الكيمياء الحيوية Biochemistry Lab

2 مقياس الطيف الضوئي الجلسة األولى والثانية: Spectrophotometer أطياف اإلشعاع الكهرومغناطيسي Electromagnetic Spectra يمكن تقسيم هذه األطياف بحسب طول موجتها إلى ستة أطياف أهم ها هنا اثنان: 1. طيف األشعة فوق البنفسجية UV) :(Ultraviolet وتقع أطوال موجاته ضمن المجال نانومتر وهو غير مرئي بالعين المجردة. 2. طيف األشعة المرئية :(Visible) وتقع أطوال موجاته ضمن المجال نانومتر وهو مرئي. قياس الطيف Spectroscopy هو استخدام امتصاص (Absorption) أو إصدار (Emission) أو بعثرة (Scattering) الذرات أو الجزيئات لإلشعاع الكهرومغناطيسي لدراسة هذه الذرات أو الجزيئات كم ا أو كيفا أو لدراسة العمليات الفيزيائية. إن التفاعل بين المادة واإلشعاع سيؤدي إلى تغيير اتجاه األخير مع أو بدون انتقال المادة بين المستويات المختلفة للطاقة.

3 الكيمياء الحيوية عملي يحدث في االمتصاص (Absorption) انتقال المادة من مستوى طاقة أدنى إلى مستوى طاقة أعلى مع انتقال الطاقة من حقل اإلشعاع إلى المادة. وإذا انتقلت المادة من مستوى طاقة أعلى إلى مستوى طاقة أدنى فيدعى (Emission) إذا حدث انتقال الطاقة من المادة إلى حقل اإلشعاع أما فيسمى بالتفكك (Decay) غير اإلشعاعي. باإلصدار بدون انتقال الطاقة وأما البعثرة )التبعثر( فهو تغي ر اتجاه الضوء نتيجة تفاعله مع المادة وهو قد يحدث مع انتقال الطاقة أو بدونها. طيف االمتصاص: Spectrum Absorption تمتلك كل مادة طيف امتصاص خاصا بها يمكن استخدامه لكشفها في محلول ما. يمكن الوصول إلى هذا الطيف من خالل رسم منح ن (Curve) يمث ل كمية الضوء الممتص بأطوال موجاته المختلفة. وسيكون لكل مادة ذروة واحدة على األقل عند طول موجة معين )أي يكون امتصاصها للضوء عند طول الموجة هذه أعظم امتصاص( طول الموجة هذا سيستخدم لقياس تركيزه )أي تركيز هذه المادة(.

4 قياس تركيز مادة ما باستخدام شدة امتصاصها للضوء يمكننا القيام بذلك من خالل تطبيق قانون بيير المبرت Lambert) (Beer أو قانون بيير Beer الذي ينص على أن : كمية الضوء الذي تمتصه المادة المذابة (A) تتعلق بتركيزها (C) وبالمسافة التي يقطعها الضوء خاللها (b) ويمكن التعبير عن ذلك بالشكل التالي: A = K b C (1) حيث أن K هي معامل االمتصاص المتعلق بطول الموجة وهو ثابت طالما أن الموجة ثابتة والمادة هي ذاتها. ويتضح من هذا أنه إذا قسنا االمتصاص وعرفنا تلك الثابتة يمكن الوصول إلى تركيز المادة. تستخدم المخابر أجهزة حديثة ومتنوعة لقياس تركيز المادة في محلول ما اعتمادا على مدى امتصاصها للضوء بموجاته المختلفة. وأكثر هذه األجهزة استخداما هو مقياس الطيف الضوئي.(Spectrophotometer) تعتمد هذه األجهزة على فكرة النفوذية (Transmittance) والتي يرمز لها بالرمز (T) وتعر ف بأنها نسبة الضوء النافذ (I) )شدة الضوء الخارج بعد مروره في المحلول( إلى نسبة الضوء الساقط )المطبق على المحلول( ) 0 I) أي: T = I I 0 (2)

5 الكيمياء الحيوية عملي فإذا علمنا أن العالقة بين االمتصاصية (A) والنفوذية (T) هي: A = log T A = log 1 = log I 0 فإن : بحسب المعادلة (2) T I فإذا استبدلنا A بقيمتها من المعادلة (1) سيكون: نسمي القيمة الضوئية K b C = log I 0 I = OD (3) I 0 /I " االنطفائية وإن كانت تسمى عرفا بالكثافة أو شدة االمتصاص والتي يعطينا الجهاز قيمتها عبر شاشة رقمية أو مؤشر.)على العموم سنستمر باستخدام التعبير الشائع. كيف نستفيد من هذه القراءة في تحديد تركيز المادة يمكن أن يتم ذلك بإحدى طريقتين األولى هي رسم الخط البياني المعياري (Standard Curve) الثانية هي بقراءة الكثافة الضوئية لعينتين األولى مجهولة التركيز واألخرى معروفة التركيز على الجهاز ذاته وبطول الموجة ذاته. قبل شرح هاتين الطريقتين ال بد من معرفة األجزاء األساسية لمقياس الطيف الضوئي يتكون هذا المقياس من: 1. مصدر الضوء: و هو لمبة التنغستين )للطيف المرئي( أو لمبة الهيدروجين أو الديوتريوم )لطيف األشعة فوق البنفسجية( ويعطي في كال الحالتين ضوءا متعدد الموجات واالتجاهات ينتقل عبر المنفذ الصغير. (Monochromator) إلى موحد الموجة (Slit)

6 2. موحد الموجة :Monochromator الذي يخرج منه من الطرف اآلخر حزمة متوازية بطول موجة واحدة تمر عبر المنفذ الثاني لتصل إلى العينة )الحظ أن طول هذا المسار من المنبع حتى الطرف الثاني من العينة ثابت(. 3. العينة: التي نريد معرفة تركيزها..4 الكاشف :Detector وهو يكشف كمية الضوء النافذة من العينة..5 المضخم.Amplifier.6 الشاشة :Readout والتي يظهر عليها الكثافة الضوئية التي يحددها الجهاز. How does a Spectrophotometer work?

7 :(Standard Curve) الطريقة األولى: رسم الخط البياني المعياري تحضير سلسلة من المحاليل معروفة التركيز. قراءة الكثافة البصرية لكل منها وتسجيلها بحيث نحصل على الكثافة البصرية لكل تركيز. تمثيل النقاط على منحني بياني بحيث يكون المحور X هو التركيز والمحور Y هو االمتصاصية. وصل النقاط فيتشكل خط بياني يمثل الخط البياني المعياري الذي يجب أن يمر ب %57 من النقاط على األقل. ويمكن من خالل هذا الخط معرفة تركيز أي محلول مجهول من المادة ذاتها بمجرد معرفة شدة امتصاصه للضوء. الطريقة الثانية: قياس امتصاصية المجهول والمعلوم :(Standard) )العياري( لنفترض أن لدينا محلوال مجهول التركيز من مادة ما )نرمز لتركيزه باالختصار.)Ct وآخر تركيزه معروف (Cst) )تركيز العياري( من المادة ذاتها. فإذا عرفنا الكثافة البصرية للمجهول (ODt) والعياري (ODst) بواسطة مقياس الطيف الضوئي يمكن تطبيق المعادلة (3) على كل منهما كما يلي: ODt = K b Ct ODst = K b Cst في الحالتين واحدة ألن المادة وطول الموجة هما ذاتهما وكذلك b ألنها ثايتة في الجهاز. مالحظة: K

8 بشكل آخر: وهذا يعني أن: الكيمياء الحيوية عملي ODt Ct ODst = K b = Cst أي أن : ODt Ct = ODst Cst (4) Ct = Cst ODt ODst وطالما أننا نعرف تركيز العياري ونقرأ الكثافة الضوئية على الجهاز فإنه يمكن حساب تركيز المجهول (Ct) وتكون الوحدة هي ذاتها وحدة تركيز العياري )ملغ/دل مثال (. وال بد من التذكير هنا أنه في كل التجارب التي سنجريها يجب تحضير ثالثة أنابيب فيها ثالثة محاليل تحتوي جميعها على الكواشف ذاتها وهي: 1. أنبوب العينة أو المجهول Tube) :(Test ويحتوي إضافة للكواشف كمية محددة من العينة المجهولة. 2. أنبوب العياري أو معلوم التركيز :(Standard) ويحتوي باإلضافة للكواشف كمية محددة من المحلول العياري. 3. أنبوب بالنك :(Blank).1 وتغيب عنه المادة المتفاعلة التي ستنتج اللون ويستخدم لضبط الجهاز )تصفيره(. مالحظات: هناك طريقتان مستخدمتان للقياس هما طريقة النقطة النهائية Method) (End-Point والطريقة الحركية Method).(Kinetic طريقة النقطة النهائية: نعطي فرصة للتفاعل ليتم )وقت محدد( ثم نقيس ونأخذ القراءة الطريقة الحركية: )غالبا ما تستخدم مع اإلنزيمات( )أي قراءة واحدة(. فيتم حساب التركيز باالعتماد على تسجيل معدل تبدل االمتصاص في الدقيقة الواحدة كمية ناتج التفاعل في الدقيقة(. ( يأ.2.3 ولذلك يتم أخذ أرقام االمتصاص كل دقيقة لمدة ثالث دقائق ونحسب المتوسط ثم نضربه بعامل (Factor) محدد بحسب اإلنزيم المراد قياسه. تقوم بعض األجهزة الحديثة بإجراء كل الحسابات وتعطي التركيز مباشرة. إذا كان اللون الناتج شديد الكثافة )غامقا جدا ( فيفضل وفي النهاية نضرب بعامل التمديد. إعادة التجربة بعد تمديد العينة

9 مراحل العمل على الجهاز لكل جهاز طريقة خاصة من حيث التشغيل وطريقة إخراج النتائج )مؤشر أو رقمي أو طباعة( والقيم )كثافة ضوئية أو النتيجة النهائية على شكل تركيز إذا سبق وأعطي تركيز العياري(. على العموم هناك خطوات عامة يجب اتباعها وهي: تشغيل الجهاز وتركه لدقائق )تحمية( فيصبح جاهزا للعمل. اختيار طول الموجة المناسبة للتحليل المراد إجراؤه. لكل جهاز مكان لوضع العينة المراد قراءتها ضمنه )الحجرة الضوئية( وأنبوب خاص به يتناسب حجمه وشكله مع ذلك المكان وغالبا ما يكون على شكل متوازي المستطيالت مقطعه العرضي مربع الشكل. ويكون لهذا األنبوب وجهان متقابالن مخططان أما الوجهان المتقابالن اآلخران فيكونان شفافين ليخترقهما الضوء..(Cuvette) يدعى هذا األنبوب باسم كوفيت بعد أن نمأل العينة في هذا األنبوب نقوم كل مرة بمسحه من الخارج بمنديل ورقي ثم نضع األنبوب في مكانه المخصص )الحجرة الضوئية(. يجب االنتباه إلى احتمال ترك المنديل وبرا على الكوفيت )مما يعيق االمتصاص ويبدل النتيجة( كما يجب االنتباه ألن ال نزيد كمية المحلول عن سعة الكوفيت فيسكب المحلول على األطراف )يكفي ملء الكوفيت حتى عنقه في تجاربكم كلها(. من الضروري أيضا الحذر من لمس الطالب للوجهين الشفافين من الكوفيت وأن يوضع الكوفيت في الحجرة بحيث يكون هذان الوجهين في مسار الضوء في الجهاز. نبدأ بأنبوب بالنك فنمأل منه الكوفيت ثم نمسحه ونضعه في الحجرة ونضغطه بلطف حتى يالمس قاعدتها ثم نغلق الغطاء الخارجي ونقوم بتصفير الجهاز )نزيح المؤشر إلى الصفر(. ننزع الكوفيت من الحجرة ونفرغه ثم نملؤه من األنبوب العياري وننظفه كالعادة ثم نضعه في الحجرة ونغلق الغطاء فيظهر المؤشر قيمة االمتصاصية نسجل الرقم وهو عبارة عن الكثافة الضوئية للعياري )أي.)ODst نعيد الخطوة 7 لكن نمأل الكوفيت من أنبوب العينة وتسجل القراءة بعد إغالق الغطاء فتكون هي الكثافة الضوئية للعينة مجهولة التركيز.(ODt)

10 بعد االنتهاء من العمل ننظف الكوفيت جيدا واألنابيب التي تم العمل بها ومكان العمل وذلك بغسيل كل هذه األشياء وتنشيفها ثم نبدأ الحساب بتطبيق المعادلة رقم 4 أي: تركيز المجهول = تركيز العياري )الكثافة الضوئيةللمجهول/الكثافة الضوئية للعياري( Ct = Cst (ODt/ODst) الوحدة كما هي تركيز العياري. مخطط شامل لمراحل العمل على الجهاز: تشغيل الجهاز واختيار طول موجة مناسب التعرف على الكوفيت )األنبوب( ومكان توضعه والمحافظة على نظافته نبدأ بملئ الكوفيت أوال بأنبوب بالنك لتصفير الجهاز ومن ثم باألنبوب العياري للحصول على ODst ومن ثم بأنبوب العينة للحصول على ODt ثم نقوم بتنظيف كل أدوات العمل وأخيرا نقوم بالحسابات للحصول على تركيز تلك العينة

11 الكيمياء الحيوية عملي مالحظات عملية: ينطبق القانون السابق على كل الحاالت التي نأخذ فيها الحجم ذاته )أو الكمية ذاتها( من كل من المجهول والعياري فإن كان األمر غير ذلك سيكون هناك تعديالت على القانون سنأتي على ذكرها مع كل تجربة. لن نستخدم أنبوب البالنك في تجاربنا وسيتم تصفير الجهاز على الهواء. إذا لم يكن مؤشر الجهاز على الصفر اطلب المشرف للمساعدة. احرص على تنظيف الكوفيت قبل وبعد استخدامك لها والتأكد من شفافية الوجهين الشفافين وعدم وجود بصمات أو بقع أو أوساخ عليهما ومن وضعهما في مسار الضوء )بحيث يكون السهم الموجود على الكوفيت باتجاهك(. يمنع دخول الطالب بدون الرداء األبيض ويمنع خلعه إال بعد الخروج من المخبر. احرص على فهم مبدأ المعايرة ودو ن كل من الكواشف المستخدمة في كل تجربة. للتحويل من الوحدات الشائعة )ملغ/دل( إلى الوحدات الدولية )ممول/ل( نضرب األولى بالرقم 11 ونقسم الوزن الجزيئي للمادة المقاسة. حاول دوما أن تقوم بعمل أنبوب المجهول والشاهد )العياري( في الوقت ذاته أي تطبيق الخطوات ذاتها عليهما معا.

12 الجلسة الثالثة: معايرة الغلوكوز الغلوكوز عبارة عن سكر سداسي (Hexose) ألدوزي (Aldose) يتم الحصول عليه من هضم وامتصاص السكريات الثنائية وعديدات السكاريد الغذائية. يستخدم الجسم الغلوكوز ألغراض عديدة ويخزن الفائض منه على شكل غليكوجين في الكبد والعضالت وشحوم ثالثية في النسيج الشحمي. وعند الصيام يقوم الكبد بتحرير الغلوكوز إلى الدم من الغليكوجين المخزون فيه فإذا امتد الصيام طويال يبدأ بتصنيعه من مواد غير سكرية )الحموض األمينية بشكل رئيس( في عملية تدعى استحداث الغلوكوز.(Gluconeogenesis)

13 وظائفه أهم وظائف الغلوكوز هو كونه مصدر الطاقة الرئيس لمعظم الفعاليات الخلوية مع وجود خاليا تعتمد كليا على الغلوكوز كمصدر للطاقة )أي أنه مصدر الطاقة الوحيد( كالكريات الحمراء وشبكية العين...وأخرى ال يمكن أن تستمر في الحياة بدون الغلوكوز كالدماغ. وأكثر ما يميزه كمصدرللطاقة هو كونه الوحيد الذي يمكن الحصول منه على الطاقة في غياب األكسجين وفي الخاليا التي ال تحتوي على المتقدرات. يتم دخول الغلوكوز إلى الخاليا بواسطة نواقل بروتينية خاصة تدعى نواقل الغلوكوز باستثناء النواقل الموجودة في العضالت الهيكلية والنسيج الشحمي ومركز الشبع في الدماغ فإن عمل نواقل الغلوكوز ال يحتاج إلى األنسولين. األنسولين هو عبارة عن هرمون ينشط السبل االستقالبية التي تؤدي إلى خفض سكر الدم وهو الهرمون الوحيد الخافض لسكر الدم. تعمل هرمونات أخرى أهمها الغلوكاغون واألدرينالين والستيروئيدات القشرية على رفع سكر الدم وهي تسمى الهرمونات الرافعة لسكر الدم بآلية معاكسة لعمل األنسولين )ولذلك تسمى الهرمونات المضادة لألنسولين( حيث تنشط كل العمليات االستقالبية التي تزيد سكر الدم. يتم الحفاظ على سكر دم المصل والبالزما ضمن الحدود الطبيعية في حالة الصيام ) ملغ/دل أو ميليمول/ل( والطعام )أقل من 141 ملغ/دل( بالتوازن بين عمل الهرمونات ويمنع إطراحه في البول ما لم يتم يتجاوز مستواه في الدم العتبة الكلوية ) ملغ/دل(. هي الحد الذي إذا تجاوزته نسبة سكر الدم يؤدي إلى طرح السكر مع البول بما يعرف بالبيلة الغليكوزيدية.

14 األهمية الطبية لقياس الغلوكوز في المصل تشخيص بعض األمراض كالسكري والتفريق بين البيلة الغلكوزيدية الناجمة عن ارتفاع سكر الدم وتلك الناجمة عن الخلل في وظيفة الكلية ويتم ذلك من خالل التمييز حسب األعراض على الرغم أن البول يحوي الغلوكوز في الحالتين. فغلوكوز المصل يرتفع في: حاالت فيزيولوجية كتناول الطعام والتدخين والكرب )الشدة( والقهوة ومع تقد م العمر. نقص تصنيع وإفراز األنسولين كما في النمط الشبابي من الداء السكري. مقاومة األنسجة لألنسولين كما في النمط الثاني من الداء السكري )وقد يكون هنا األنسولين زائدا في الدم(. داء السكري الثانوي: بسبب التهاب البنكرياس المزمن وكل األمراض التي تؤدي إلى زيادة الهرمونات الرافعة لسكر الدم (Anti-Insulin) كزيادة الكورتيزول إما بسبب داء كوشينغ أو نتيجة المعالجة الدوائية. ينخفض غلوكوز المصل في حاالت مثل: قصور الكبد بسبب عوز أنزيم غلوكوز -3- فوسفاتاز حيث يقوم هذا األنزيم بتحرير الغلوكوز من الكبد إلى الدم. الجرعة المفرطة لألنسولين عند مرضى السكري. ورم األنسولينوما )ورم في البنكرياس يترافق مع فرط أنسولين الدم(. مرض كلوي يحد من قدرتها على إعادة امتصاص الغلوكوز )من النبيبات القريبة(. التهاب بنكرياس حاد Glucose:

15 الكيمياء الحيوية عملي العينة تؤخذ من: المصل: ويجب فصله وإجراء التحليل بسرعة لكي ال يتم استهالك الغلوكوز من قبل خاليا الدم )تحلل السك ر( فنحصل على أرقام ناقصة وغير دقيقة )ينقص مستوى الغلوكوز بنحو %7 من قيمته في الساعة(. البالزما باستخدام فلوريد الصوديوم كمضاد للتخثر: وهنا يمكن االنتظار حيث لن تقوم الخاليا باستهالك الغلوكوز ألن فلوريد الصوديوم يوقف التحلل السكري. السائل الدماغي الشوكي.CSF مالحظة: ال يجوز استخدام عينة الدم المنحل في قياس الغلوكوز ألنه عند انحالل الدم يخرج السكر من داخل الخاليا عبر أغشيتها إلى البالزما فيكون قياسنا للغلوكوز هو قياس للغلوكوز الكلي وليس الحقيقي المصلي. المعايرة مبدأ يمتلك الغلوكوز وظيفة ألدهيدية قادرة على إرجاع محلول كاشف هاردينغ B المعد ل فيتحول لونه من الشفاف إلى األزرق تتناسب شدة اللون األزرق )وبالتالي الكثافة الضوئية( طردا مع تركيز الغلوكوز في المحلول. ألنه ال يجوز استخدام الدم المنحل في معايرة الغلوكوز يجب أن نضيف للعينة محلوال أسوي التوتر يمنع انفجار الكريات الحمر )وهو كبريتات الصوديوم النحاسية( كما أن بروتينات العينة يمكن أن تؤد ي إلى العكر وبعضها ربما يكون مرجعا ولذلك ال بد من ترسيب البروتينات في العينة بإضافة محلول تنغستات الصوديوم.

16 مراحل العمل: 1. تحضير أنبوب العمل: نضع في أنبوب مثفلة: 0.05 مل من المصل مل من كبريتات الصوديوم النحاسية مل من تنغستات الصوديوم. نمزج األنبوب جيدا ثم نضعه في المثفلة لمدة 5 دقائق فيتشكل الراسب أسفل األنبوب ويبقى السائل الطافي في األعلى. 2. تحضير أنبوب المجهول وأنبوب الشاهد )العياري(: )أنبوبا اختبار طويالن( كما في الجدول التالي: المادة كاشف هاردينغ العينة )السائل محلول العياري نمزج األنبوبين جيدا )0.05 ملغ/مل( األنبوب الطافي( ونتركهما في الحامل 5 دقائق )لماذا ( العياري 2 مل لمدة مل المجهول --- ثم نقيس االمتصاصية 2 مل 2 مل )*( على طول الموجة 600 نانومتر )*( الحظ أننا أخذنا فقط 2 مل من محتويات أنبوب العمل )وحجمها 4 مل( أي أننا أخذنا فقط نصف ما يحتويه من العينة األصلية. هذا يعني أننا أخذنا من العينة حجما وقدره مل فقط بتطبيق القانون المستخرج سابقا نجد أن : تركيز المجهول = الكثافة الضوئية للمجهول الكثافة الضوئية للمعياري الحساب والنتيجة: تركيز العياري = الكثافة الضوئية للمجهول الكثافة الضوئية للمعياري 0.05 ملغ/دل 100 مل=دل ما أخذ من العينة 100 مل مل 200 ملغ/دل = الكثافة الضوئية للمجهول الكثافة الضوئية للمعياري Cst = ODst/ ODt 200 mg/dl أي:

17 الكيمياء الحيوية عملي الجلسة الرابعة: اإلنزيمات وتشخيص أمراض الكبد معايرة ناقالت األمين في المصل ذكرنا سابقا أن اإلنزيمات الخلوية تصل إلى الدم بمقادير محدودة في األحوال الطبيعية )المجال المرجعي( كنتيجة لتخر ب الخاليا الهرمة بعد انتهاء عمرها. يوحي هذا بأن التخرب الخلوي الزائد )المرضي( سيؤدي إلى زيادة كميات هذه اإلنزيمات في البالزما والسؤال الذي يطرح نفسه هو كيف ينخفض تركيز هذه اإلنزيمات الحقا في الحالتين الطبيعية والمرضية يتم عادة تصفية هذه اإلنزيمات من الدم وكغيرها من المواد األخرى بوسائط عدة منه: A. إطراحها في البول )إذا كانت صغيرة الحجم والوزن الجزيئي كاألميالز والليباز مثال(. B. إطراحها في الصفراء )كالفسفتاز القلوية(. C. حلمهتها بواسطة إنزيمات بروتياز Proteases المصل. D. تخريبها في بعض األنسجة كالجملة الشبكية البطانية أو التقاطها من قبل الكبد وتخريبها. وألننا ال نستطيع قياس تركيز اإلنزيمات نلجأ إلى قياس فعاليتها في ونعطي النتيجة بالوحدة الدولية/لتر. المصل هذا يعني أن ه سيكون التعبير علميا أكثر إذا قلنا تزداد فعالية الإلنزيم في المصل أكثر من قولنا يزداد تركيزه. acid phosphatase من النادر أن نجد إنزيما نوعيا لنسيج ما )الفسفتاز الحامضة نوعية للبروستات( فمعظم اإلنزيمات توجد في أكثر من نسيج وأعمارها النصفية مختلفة. يصعب نتيجة لذلك تحديد مصدر ارتفاع هذه اإلنزيمات وتحديد العضو المصاب )حيث أن ارتفاع تركيز هذه األنزيمات يمكن أن يدل على وجود أذية في نسيج ما(.

18 إحدى طرائق التغلب على هذه الصعوبة هو معرفتنا بأن تراكيز هذه اإلنزيمات مختلف بين األنسجة )مما يعني أن مقدار الزيادة سيختلف عند أذيتها( وأن هناك نظائر إنزيمية تفرزها بعض األنسجة دون غيرها )أو أكثر من غيرها(. أحد أسباب ارتفاع الفسفتاز القلوية هو انسداد المجاري الصفراوية في الكبد. تجدر اإلشارة هنا إلى أن أمراض الكبد يمكن أن تؤدي إلى: تخر ب صرف في الخلية الكبدية )كالمراحل األولى من التهاب الكبد الفيروسي أو الدوائي أو السم ي( أو انسداد صرف في القنوات الصفراوية )كما في الحصيات الصفراوية وورم رأس البنكرياس( وما بين هاتين الحالتين توجد درجات متفاوتة من التخرب واالنسداد )فالتهاب الكبد سيترافق مع تقدمه بانسداد في القنيات الصفراوية واالنسداد سيؤدي إلى بعض التخرب في الخلية الكبدية نتيجة أذيتها بمكونات الصفراء(. ستجد في الفصل الثاني عند دراستك لالستقالب: أن الكبد هو العضو األكثر مساهمة في استقالب الحموض األمينية وأن أهم اإلنزيمات في هذا االستقالب هي ناقالت األمين.

19 إن معظم الحموض األمينية التي ترد إلى الكبد من العضالت ستكون على شكل أالنين. ولن تجد صعوبة في استنتاج أن ناقالت األمين ستكون في الكبد أكثر من غيره )وليست حكرا عليه(. وعلى األخص ناقلة األمين الخاصة باألالنين وهي "ALT" )transaminase وكانت تسم ى سابقا ناقلة أمين األالنين Alanine ( Transaminase( )Glutamate-Pyruvate واختصارها الحرف األول من كلمة.Serum ناقلة أمين الغلوتامات للبيروفات حيثS "SGPT" هو وهي توجد بكميات قليلة جد ا في أنسجة أخرى من الجسم على عكس الكبد الذي يحوي كميات كبيرة منها. أما ناقلة األمين األخرى الشائعة فهي ناقلة أمين األسبارتات (Aspartate transaminase "AST") وكانت تسمى سابقا ناقلة أمين الغلوتامات لألوكزاالت المصلية Transaminase( (Glutamate-Aspartate واختصارها هو.SGOT وهي نوعية للقلب والعضالت أكثر من الكبد حيث توجد فيه بكميات أكبر بكثير توجد أيضا في الكلية والكريات الحمر وغيرها. إذا ناقالت األمين توجد في الكبد أكثر من أي عضو آخر في الجسم وناقلة األمين الشائعة هي ناقلة أمين األسباراتات. وألن الكبد أكثر األعضاء استقالبا للحموض األمينية فسيحتاج أيضا إلنزيم يسرع عملية نقلها إلى داخل خالياه وتشاركه في ذلك األمعاء والكلية. Gamma Glutamyl Transpeptidase هذا اإلنزيم هو ناقلة ببتيد الغاما غلوتاميل واختصار االسم هو GGT أو.γGT

20 يرتبط هذا اإلنزيم بغشاء الخلية الكبدية من الخارج )كما الفسفتاز القلوية وهذا يعني أن ارتفاعها قد يدل على ( ويعمل على نقل الحموض األمينية إلى داخل الخلية. يتحرض تصنيع هذا اإلنزيم بالكحول ولذلك يرتفع أيضا عند الكحوليين وكذلك في التهابات الكبد الكحولية والسمية والفيروسية. يختلف العمر النصفي لهذه اإلنزيمات من ± ساعات إلنزيم GPT و 14 ± 5 ساعات إلنزيم GOT و 7-3 أيام إلنزيم.GGT عمل ناقالت األمين كما قلنا أعاله تهتم هذه اإلنزيمات باستقالب الحموض األمينية مما يوحي بأهمية دورها )كما سيتضح لك في الفصل الثاني( في تصنيع الحموض األمينية غير الضرورية في الجسم وتفاعالت إنتاج الطاقة واستحداث الغلوكوز Gluconeogenesis في الكبد في حالة الصيام. هناك ناقل أميني نوعي متخصص لكل حمض أميني ماعدا الليزين والثريونين والبرولين وهيدروكسي البرولين ويحتاج في عمله لوجود التميم اإلنزيمي بيريدوكسال- 7 -فسفات PLP المشتق من الفيتامين. تحف ز هذه اإلنزيمات نقل مجموعة األمين من حمض أميني ألفا إلى حمض كيتوني- ألفا ليتشكل حمض أميني-ألفا وحمض كيتوني-ألفا جديدين. يبين الشكل جانبا عمل إنزيم ي ALT و AST الحظ أن التفاعل عكوس: المجاالت المرجعية )وحدة دولية/لتر :)IU/L ALTو :GGT 10_50 :AST أقل من 60.

21 مبدأ معايرة فعالية ناقلة أمين األالنين )ALT( )GPT( في المصل بطريقة كينغ King حضن إنزيم ALT )الموجود في المصل( بدرجة الحرارة 33 مئوية مع ركيزتيه )األالنين وألفا-كيتوغلوتارات( ليقوم بتحفيز نقل األمين فتتشكل النواتج )البيروفات والغلوتامات(. يتفاعل البيروفات )الحصرمات( مع الكاشف اللوني )2-4 ثنائي نتروفينيل الهيدرازين( فيتشكل معقد بيروفات الهيدرازون ذو اللون البني المحمر. تتناسب شدة اللون مع كمية البيروفات المتشكلة وبالتالي مع فعالية اإلنزيم. مراحل العمل: تحضير انبوبين )مجهول وشاهد( وإضافة المواد إليهما بحسب المراحل التالية من اليمين لليسار: NaOH )إيقاف التفاعل( المادة األنبوب الركيزة المصل )إنزيم( حضن ) 73 م( بيروفات شاهد ماء الكاشف اللوني انتظار بدرجة حرارة قياس الكثافة الضوئية المجهول الشاهد مل الغرفة لمدة 5 دقائق مل عند الموجة 525 نانو متر 5 5 مل مل مل 0.4 مل 15 دقائق ال داعي 0.2 مل 1 مل 0.6 مل الحساب: الحظ أن النسبة المئوية للناتج )أي البيروفات( في الشاهد هي %05 هذا محلوال يحوي البيروفات بنسبة %05 يعطي الكثافة الضوئية التي قرأتها للشاهد )ك ش ) إذا ماهي النسبة المئوية لتركيز البيروفات في المجهول وبمعنى آخر ماهي نسبة تحويل الركيزة )أالنين( إلى ناتج )بيروفات( في المجهول نسبة التحويل= )كم ك ش ) %41

22 الجلسة الخامسة: معايرة إنزيم الفسفاتاز القلوية مقدمة: إنزيمات البالزما )المصل(: مصادرها وفوائدها إن قياس األنزيمات في البالزما ذو أهمية بالغة في تشخيص أمراض أجهزة الجسم المختلفة وتدبيرها من حيث مراقبة تطور هذه األمراض ومدى التحسن الذي توفره المعالجة وتقرير الشفاء وتشخيص حاالت النكس. يمكن تصنيف اإلنزيمات الموجودة في البالزما إلى مجموعتين رئيسيتين: األنزيمات الوظيفية: وهي التي تفرز بشكل فاعل إلى الدم لتقوم بوظائفها ضمنه أي أن لها وظائف محددة تقوم بها في الدم. معظم هذه اإلنزيمات يصنعها الكبد ويطرحها في الدم ومنها عوامل التخثر وعوامل متممة والرينين )يفرز من الكلية(. األنزيمات غير الوظيفية: وهي التي ال تقوم بأية وظيفة في الدم ومكان عملها الحقيقي هو ضمن الخاليا. وفي األحوال الفيزيولوجية الطبيعية تصل هذه اإلنزيمات إلى الدم بسبب موت الخاليا وتخر بها بعد انتهاء عمرها الزمني فتتحرر محتوياتها بما في ذلك اإلنزيمات الخلوية إلى النسيج الخاللي ومنه تصل إلى الدم. تضم األمثلة على هذه اإلنزيمات كال من ناقالت األمين AST( و )ALT ونازعة هيدروجين الالكتات )LDH( وناقلة الغاما-غلوتاميل )GGT( والفسفاتاز القلوية )ALP( وغيرها من اإلنزيمات الموجودة داخل الخاليا. إن أي ة زيادة في موت الخاليا وتخربها - والذي ينجم عن المرض عادة يترافق مع زيادةفي كميات اإلنزيمات التي ستتحرر من الخاليا المتموتة فيزيد تركيزها في الدم. هذا يعني أن ارتفاع تركيز هذه اإلنزيمات يمكن أن يساعد في تشخيص الحالة المرضية أو -على األقل- يوج هنا إلى العضو أو الجهاز المصاب. كما أن عودة هذا التركيز إلى الطبيعي بعد ارتفاعه لفترة يشير إلى توقف التخرب والشفاء..i.ii

23 الكيمياء الحيوية عملي عوامل التخثر عوامل متم مة تقوم بوظيفتها بالدم وظيفية الرينين ناقالت األمين األنزيمات نازعة هيدروجين الالكتات الفسفاتاز القلوية تقوم بوظيفتها بالخاليا غير وظيفية ناقلة الغاما غلوتاميل يجب االنتباه إلى أن هذه الزيادة في تركيز اإلنزيمات واألذية النسيجية فهناك آليات أخرى: o زيادة معدل تقلب )Turnover( الخلية. ليست دوما دليال على التخرب الخلوي o التكاثر السريع للخاليا )كما في األورام(. o تحريض تصنيع اإلنزيمات )مثال : الركودة الصفراوية تحرض تصنيع الفسفاتاز القلوية(. o انسداد طرق اإلطراح خارج الجسم )األميالز ت طرح في البول والفسفاتاز القلوية في الصفراء(. o نقص معدل تصفية البروتين من الدم )معظم بروتينات البالزما يصفيها الكبد بعد انتهاء عمرها(. نقيس عادة تركيز اإلنزيم في البالزما من خالل قياس فعاليته اإلنزيمية )نشاطه اإلنزيمي( فيها. ويعتمد النظام الدولي مبدأ قياس النشاط اإلنزيمي في لتر واحد من البالزما والذي يحرر 1 مكمول من الركيزة خالل دقيقة واحدة وتكون وحدة القياس هي وحدة دولية في اللتر.)IU/L(

24 من مساوئ استخدام قياس اإلنزيمات كوسيلة تشخيصية وجود هذه اإلنزيمات في خاليا الجسم المختلفة أي أنها غير نوعية تماما لذلك يصعب نتيجة لذلك تحديد مصدر ارتفاع هذه اإلنزيمات وتحديد العضو المصاب. معايرة إنزيم الفسفاتاز القلوية ALP ( )Alkaline Phosphatase التسمية والعمل الكيميائي: ينتمي هذا اإلنزيم إلى مجموعة من اإلنزيمات التي يكون نشاطها األقصى في الوسط القلوي ) بحسب الركيزة( أما عملها فيتضمن: حلمهة فسفات إسترات الفسفات العضوية )تفاعل 1(. نقل الفسفات من إستراتها إلى الكحوالت )تفاعل 2(. حلمهة البيروفسفات )تفاعل 3(. يتطلب عملها وجود شوارد المغنزيوم وت ثب ط بال.EDTA

25 الكيمياء الحيوية عملي التوزع يوجد أنزيم فسفاتاز القلوية في معظم خاليا الجسم. إال أن أكبرها تركيزا هي الخاليا بانيات العظم )Oteoblasts( الخلية الكبدية )توجد على أغشيتها في المحاذية للقنيات الصفراوية والجيوب الوريدية( ثم الخاليا الظهارية في األمعاء. كما يوجد في خاليا المشيمة وغدد الثدي خالل اإلرضاع. تفرز كل من هذه األنسجة شكال متميزا بصفاته الفيزيائية لكنها تشترك في الفعالية التحفيزية نفسها )<من 17 نظير أنزيمي( وبعض األنسجة تفرز أكثر من نظير )الكبد< 7 نظائر(. تختلف هذه النظائر في: حركيتها في الرحالن الكهربائي. درجة الحرارة المطلوبة لتثبيطها. نوع الحمض األميني الذي يثبطها )يثبط الفينيل أالنين النظيرين المشيمي والمعوي أكثر من العظمي والكبدي(. يوجد في هذه النسج مرتبطا بالغشاء الخلوي ليسهم بنقل الفسفات عبره. إن دوره األهم هو الدور الذي يقوم فيه ببناء العظم. الوظيفة حيث يأتي القوام الصلب للعظم بشكل أساسي من ملح األباتيت المكون من أمالح فسفات الكالسيوم )مع الصوديوم المغنزيوم..( تقوم الفسفاتاز القلوية بحلمهة استرات الفسفات العضوية لتزداد كمية الفسفات في الوسط المحيط إلى الحد الذي تتجاوز فيه الجداء األيوني للكالسيوم والفسفات )41( فتنقص انحاللية الكالسيوم ليتحد مع الفسفات بشكل ملح راسب يشكل أساس المادة الصلبة للعظم.

26 المصادر الفيزيولوجية لفسفاتاز البالزما الكبد بشكل رئيس مع كمية قليلة من االمعاء وأقل بكثير أو معدومة من العظام )ماعدا في مرحلة الطفولة ومراحل النمو االخرى حتى سن البلوغ(. يزداد النظير المشيمي خالل الحمل. يختلف المجال المرجعي )المجال الطبيعي( بحسب الركيزة ودرجة الحرارة والوحدة المستخدمة. بعض التغيرات الفيزيولوجية يرتفع في مراحل الطفولة والنمو حتى سن البلوغ )13-11 سنة( إلى 4-3 أضعاف الحد األعلى لقيمته المرجعية. البناء العظمي زيادة نشاط خاليا بانية العظم التي تفرز النظير العظمي لألنزيم كما يرتفع في الثلث األخير من الحمل إلى 3-2 أضعاف الطبيعي )النظير المشيمي(. يزداد بعد الوجبة الغنية بالدهون )النظير المعوي وربما الكبدي(. نتيجة: من األفضل قياس هذا األنزيم في عينة المصل المأخوذة على الريق )بعد صيام بعض التغيرات المرضية: ساعات(. يزداد نشاط هذا األنزيم البالزما إلى أكثر من 7 أضعاف الحد األعلى لقيمته المرجعية في: 1( األمراض المؤد ية لزيادة نشاط بانيات العظم كما في داء باجيت )مجهول السبب يصيب المسنين غالبا ويزداد فيه نشاط كاسرات العظم فتتحر ض بانيات العظم مما يقود إلى تشكل عظم جديد بشكل غير منتظم فتثخن العظام المصابة وتصبح مؤلمة ومشو هة( وتلي ن العظام والكساح. 2( أمراض الكبد والطرق الصفراوية داخل الكبد )كتشمع الكبد( وخارجه )حصيات أو أورام( التي تؤدي إلى الركودة الصفراوية: تعمل على تحريض تصنيع اإلنزيم. تجعل الحموض الصفراوية المتراكمة لألنزيم أكثر ذوبانية فينفصل عن الغشاء الخلوي ويكثر في النسيج الخاللي ويعود إلى الدم ألن الطرق الصفراوية مسدودة. يتحرر األنزيم من غشاء الخلية الكبدية المتأذية في التشمع.

27 الكيمياء الحيوية عملي 3( يزداد نشاط هذا األنزيم في المصل في أورام العظام واندمال الكسور وفرط نشاط جارات الدرق البدئي والتهاب الكبد في مراحله المتقدمة لماذا المرحلة النهائية من القصور الكلوي لماذا بسبب فرط تصنع الطرق الصفراوية. بسبب نقص فيتامين D الفعال ألن الكلية تلعب دورا في تركيبه. نقص فيتامين D الفعال نقص تمعدن العظام الفوسفاتاز القلوية. انتكاس بانيات العظم منتجة حاالت نقص اإلنزيم: القزامة. الكساح. نقص الفسفاتاز القلوية الوالدي وهي حالة وراثية يزداد فيها Ca الدم والبول بينما ينقص P الدم. المعايرة: أهميتها: تشخيص األمراض الكبدية الصفراوية أمراض العظم. حيث تستخدم كواصمة لألورام بسبب كثرة النظائر تفقد قيمتها التشخيصية في هذا المجال لكن يمكن استخدامها لتقييم نجاعة العالج. مبدأها: إضافة المصل )الحاوي لألنزيم( إلى محلول يحوي ركيزة األنزيم )أحد أسترات الفسفات( في وسط قلوي تؤمنه الدارئة )فسفات ثنائية الصوديوم( مع حضانة بدرجة 35 مئوية. تكون الركيزة عادة غير ملونة. بعد قيام األنزيم بعمله يتحرر الفسفات من الركيزة التي تتحول إلى مركب آخر )الفينول( حيث يأخذ لونا أزرق عند اتحاده بالكاشف الم ظهر للون )فولن شيوكالتو(.

28 يمكن بالتالي قياس شدة اللون بمقياس الطيف الضوئي وتكون شدته متناسبة مع تركيزه وبالتالي مع قوة عمل األنزيم المتناسب مع تركيزه. الركيزة في التجربة هي فسفات الفينيل )غير ملونة(. الناتج هو الفينول الذي يعطي اللون األزرق بوجود فحمات الصوديوم وكاشف فولن- شيوكالتو. الكاشف فولن-شيوكالتو: يتكون من: تنغستات الصوديوم + موليبدات الصوديوم + حمض الفوسفور + حمض كلور الماء الكثيف + سلفات الليثيوم + البروم. وظائفه: تخثير البروتين ومنع العكر إيقاف التفاعل وإظهار اللون. طريقة المعايرة: a( أنبوبان )مجهول+عياري( في نفس الوقت: حضن )35 م ) o ركيزة دارئة شاهد مصل ماء مقطر كاشف في حال ظهور عكر: تثفيل مجهول عياري 2 مل مل مل --- األنبوب+ترشيح أو ترشيح فقط. 1.8 مل دقيقة مل مل نأخذ 4 مل من السائل الطافي )الرائق( من كل أنبوب ونضيف لكل منهما 2 مل من فحمات الصوديوم ونمزجها جيدا وننتظر 11 دقائق. قراءة الكثافة اللونية على الجهاز )طول الموجة نانومتر(. )b )c

29 الكيمياء الحيوية عملي الحساب: نطبق القانون التالي بحيث يصبح نشاط الفاسفاتاز مقدرا بواحدة كينغ أرمسترونغ مساويا ل: كثافة المجهول عدد الميكرو غرامات المأخوذة من الفينول الشاهد حجم السائل عند الحضن(مل) 1000 حجم السائل الرائق المأخوذ(مل) كثافة الشاهد = كثافة المجهول 30 كثافة الشاهد أي: 100 كثافة المجهول 40 = نشاط األنزيم كثافة الشاهد حجم المصل الوحدات والمجال المرجعي تختلف وحدة نشاط الفسفاتاز القلوية حسب كل من الركيزة والدارئة والوسط التي تجري فيه المعايرة لذلك نسمع عن وحدات كثيرة. أكثر الوحدات استخداما : وحدة بودانسكي )الركيزة هي الغليسيروفسفات بيتا والمجال المرجعي هو وحدة بودانسكي/دل( وحدة كينغ أرمسترونغ )الركيزة هي فسفات الفينيل بيتا والمجال المرجعي هو 4-13 وحدة كينغ أرمسترونغ /دل عند البالغين ويرتفع إلى عند األطفال(. o o وإن وحدة الكينغ أرمسترنغ تعادل نشاط اإلنزيم الموجود في 111 مل من والذي يحرر 1 ملغ من الفينول خالل 15 دقيقة )زمن الحضن(. المصل لتوحيد هذه الوحدات: تم االتفاق على التعبير عن نشاط الفسفاتاز القلوية بال)وحدة دولية/ليتر( وهي تعبر عن نشاط اإلنزيم الموجود في ليتر مصل والذي يحرر 1 ميكرومول من الفينول في الدقيقة. لتحويل كينغ أرمسترونغ/دل إلى وحدة دولية/دل: A. الضرب ب 1111 للتحويل إلى ميكروغرام. B. التقسيم على 94 )الوزن الجزيئي للفينول( للتحويل إلى ميكرومول. C. الضرب ب 11 ليصبح النشاط مقدرا بالليتر. D. التقسيم على 17 ليصبح النشاط مقدرا خالل دقيقة من الزمن.

30 = وحدة دولية = كينغ أرمسترنغ ملغ 15/1 دقيقة/ 100 مل مصل مكم 1 /دقيقة 001/01 ليتر مصل هذا يعني أن الوحدة الدولية /ل= عدد وحدات الكينغ أرمسترونغ 4.1x أسئلة: عند ارتفاع الفسفاتاز في المصل هل من الضروري معرفة مصدرها وكيف تحدد هذا المصدر )يوجد 5 طرق على األقل( كيف تفرق بين إصابة كبدية التهابية في بدايتها )بمعنى تخرب خاليا فقط( وفي مراحلها الالحقة حيث تكون هناك عالمات االلتهاب األربعة 7 -كيف يمكن للقصور الكلوي )عجز الكليتين عن أداء وظائفهما المعتادة( أن يؤثر على العظام ويزيد فعالية الفسفاتاز القلوية

31 الجلسة السادسة: األميالز األميالز عبارة عن أنزيم من خمائر اإلماهة يتم إفرازه من: الغدد اللعابية )حيث يقوم بتفكيك النشاء تفكيكا جزئيا (. الخاليا العنبية للبنكرياس )حيث يتجه باتجاه القناة البنكرياسية الرئيسية _ قناة ويرسانغ_ثم إلى االثني عشر عبر مصرة أوزي لتصب في القسم الثاني من العفج( وتتميز العصارة البنكرياسية بقلويتها: حيث السائل يكون غني بال - HCO 3 الذي يعدل حمض كلور الماء الداخل إلى القطعة الثانية من العفج القادم من المعدة حيث يرتفع الPH داخل اللمعة إلى مستويات تصبح فيها اإلنزيمات البنكرياسية فعالة. باإلضافة أنه يفرز بتراكيز ضئيلة من المبيض األمعاء العضالت الهيكلية. عادة األنزيمات التي تفرز من البنكرياس: أنزيمات تفرز بشكل فع ال: مثل األميالز والليباز والريبونوكلياز. أنزيمات تفرز بشكل غير فع ال: وتبقى غير فعالة حتى تتحول إلى شكلها الفع ال باألمعاء الدقيقة مثل: البروتياز الفوسفوليباز حيث عندما تفرز إلى العفج تفع ل بشكل شاللي حيث يقوم الكيناز المعوي بتحويل مولد التربسين إلى تريبسين الذي يفعل كل الطالئع األنزيمية. ينفرد األميالز عن باقي األنزيمات بتواجده في البول بسبب صغر وزنه الجزيئي وبالتالي من الممكن معايرته وخاصة في الحاالت المرضية. األميالز يحول النشاء إلى السكر. الليباز عبارة عن بروتين سكري يحول الدهون إلى حموض دهنية وغليسيرول بوجود األمالح الصفراوية والكوليباز. يعتبر الليباز أكثر حساسية ونوعية من األميالز وذلك لوجوده في البنكرياس دون الغدد اللعابية. ولكن يفضل طلبه دائما مع األميالز. حساسية األميالز 75-95% في التهاب البنكرياس.

32 يبدأ بالزيادة في التهاب البنكرياس الحاد بعد 3-6 ساعات أقصاها بعد ساعة ويستمر يومين إلى ثالثة أيام )لماذا (ز حساسية الليباز أكثر من 90% في التهاب البنكرياس الحاد. يبدأ االرتفاع خالل 6-3 ساعات ليصل إلى الذروة خالل 24 ساعة ويعود إلى الطبيعي بحدود 14 يوما. لذلك هو يفضل عن األميالز ألنه: 1. يرتفع لقمة أكبر. 2. يبقى مرتفعا بعد عودة األميالز للطبيعي. 3. ال يترافق مع اضطرابات الغدد اللعابية ساعة 24 ساعة 3-6 ساعة 3-6 ساعة ساعة 14 يوم ليباز أميالز استمرار ارتفاع األميالز + الليباز أكثر من 10 أو سرطان البنكرياس. أيام يوجهنا إلى كميات كاذبة بالبنكرياس

33 الكيمياء الحيوية عملي القيم المرجعية: أميالز: وحدة/ل وحدة سوموجي/دل وحدة دوليه/ل عند ازدياد هذه النسبة في الدم يزداد استخراج هذا األنزيم عن طريق الكلى. ليباز: وحدة/ل ارتفاع أميالز المصل: التهاب البنكرياس الحاد )بشكل عالي ضعفه(. )لماذا( التهاب البنكرياس المزمن )حالة النكس والثورة الحادة(. رضوض البنكرياس. سرطان البنكرياس. التهاب أو انسداد الغدد اللعابية النكفية. الحصيات الصفراوية وحصيات القناة الجامعة )لماذا(. قرحة االثني عشر أو المعدية الثاقبة )لماذا(. تسمم حاد بالكحول )لماذا(. قصور كلوي متقدم )لماذا(. تمزق حمل هاجر. انخفاض أميالز المصل: قصور البنكرياس استئصال البنكرياس انسمام حملي تشمع كبدي _ التهاب كبد Viva RBCs

34 التطبيق العملي مراحل العمل: 1. تحضير أنبوبين وإضافة المواد كما في الجدول التالي: ماء فقط الدارئ الركيزة المادة األنبوب 5 مل 0.5 مل 0.4 مل مجهول يود مصل 0.4 مل 0.1 مل عياري 0.4 مل 0.5 مل 5 مل 0.4 مل --- مالحظة: العمل يتم في درجة الحرارة 73 درجة مئوية. الحساب: 800 فعالية أنزيم األميالز= كثافة الشاهد كثافة المجهول كثافة الشاهد الوحدة: سوموغي تعرف وحدة سوموغي بأنها كمية األميالز التي تفكك ) 5 ( ملغ من النشاء في ) 05 ( دقيقة في شروط طبيعية من درجة حرارة ) 73 ( درج مئوية.

35 الجلسة السابعة: نازعة هيدروجين الالكتات )LDH( إنزيم الكتاز ديهيدروجيناز E.C Lactate dehydrogenase LDH التفاعل تقوم هذه اإلنزيمات بتفاعل نزع هيدروجين عكوس: الكتات + + NAD LDH بيروفات + ( + )NADH+H الهدف من التفاعل: تأمين NAD من جديد. ويتم في هذا التفاعل أكسدة الالكتات إلى بيروفات بنزع ذرتي هيدروجين استخدمتا في إرجاع H + +NADH + إلى NAD + التواجد توجد في كل األنسجة خاصة : القلب القلب. الكبد. الكبد عضالت هيكلية عضالت هيكلية. كريات حمر. كلية. بنكرياس LDH RBCs رئة. بنكرياس. كلية رئة

36 النظائر يتألف اإلنزيم بنيويا من أربع تحت وحدات متماثلة وبحسب ترتيب هذه الوحدات يكون لإلنزيم خمسة نظائر مختلفة فيزيائيا ومتماثلة كيميائيا وتقوم بالوظيفة ذاتها وهي: LDH ( ) يمكن التمييز بينها بالرحالن الكهربائي حيث تتوزع هذه النظائر في األنسجة بنسب مختلفة. قليال مانلجأ لطلب الرحالن الكهربائي للنظائر ويمكن القول أن نوعية النظائر ألعضاء الجسم المختلفة هي على النحو التالي: )النسب من اإلنزيم الكلي( : LDH1 للقلب ثم للكريات الحمر )%31-27( :LDH2 للقلب - الكريات الحمر ثم للكلية )32 -%33( :LDH3 للبنكرياس - الرئة ثم للعضالت )%27-21( :LDH4 للرئة ثم للكبد والعضالت )%11-5( :LDH5 للكبد ثم للعضالت )%11-5( يمكن استنتاج التشخيص من مخطط الرحالن لهذه النظائر. الحركية في االحتشاء: يرتفع بعد االحتشاء ب 11-6 ساعة. ذروة االرتفاع بعد 17 ساعة من اإلصابة. يستمر مرتفعا )مع االنخفاض التدريجي( ل 11-5 أيام. مالحظات: أسرع نظير من النظائر هو من القلب ( 1( )األسرع بالرحالن( ثم من الكريات الحمر و أبطؤها هو الكبد )7(. كما أن النظير القلبي ال يفقد فعاليته بالتسخين ل 31 م )طريقة أخرى لتمييز النظائر عن بعضها( لفترة من الوقت المحدد. المقدار الطبيعي وحدة/ل )IU/L( أو وحدة قديمة/ل

37 متى نطلب معايرة LDH الكيمياء الحيوية عملي احتشاء القلب - أمراض القلب أمراض دم خبيثة رضوض عضلية شديدة لوكيميا أمراض كبدية حادة -أمراض الرئة الوخيمة - أمراض الكلية الشديدة. 1 الحتشاء القلب لذلك يفضل طلب أنزيمات أخرى عندها مثل CK ليست نوعية GOT )معا ( وقليال ما نلجأ لطلب الرحالن الكهربائي. مالحظة : المعايرة مالحظة: يجب أن يكون مصل صافي وليس منحال )يوجد داخل الكريات الحمر (. طريقة أنزيمية - لونية: تعتمد على حضن المصل )يحوي )LDH + ركيزة )الكتات( عند 37 م بوجود NAD هذا يعطي البيروفات التي تتفاعل مع 4 2 ثنائي تتروفينيل هيدرازين )الكاشف اللوني( مع وسط قلوي نحصل على معقد "كاشف بيروفات" لونه بني )بيروفات هيدرازون(. العمل: NaOH األنبوب المجهول ركيزة 1.7 مل 1.3 مل مصل مزج عند 73 م ل 7 دقائق بيروفات )شاهد( مل ماء كاشف ننتظر 11 د قياس الكثافة الضوئية عند الموجة 025 نم 7 مل 7 مل 1.7 مل 1.7 مل مل 1.7 مل الشاهد 1 أي ال يكفي معايرة إنزيم ال LDH لوحده لتشخيص احتشاء القلب.

38 نسبة التحويل في أنبوب المجهول = 311 <<<< %11 <<<< % حسب القديمة <<<< % )مخطط بياني( 1711 <<<< % <<<< %71 الحساب: كثافة المجهول كثافة الشاهد أنبوب الشاهد %01( 40 )نسبة التحويل في مالحظة: المقدار بالوحدة القديمة وحدة ل بالحديثة وحدة ل الوحدة الدولية IU هي كمية األنزيم الالزمة لتحويل 1 مكرو مول من الركيزة خالل دقيقة واحدة عند 73 م. طريقة أنزيمية لونية: بيروفات + H NADH + + LDH أكسدة الكتات + + NAD )لون أحمر( ديافوراز إرجاع INTH تترازوليوم( )أمالح INT + NADH + H القياس: عند 711 نانومتر وهناك تناسب طردي بين اللون وفعالية LDH في العينة. طريقة أخرى: A1- هي طريقة حركية بقياس سرعة تشكيل NADH عند 341 نانومتر بقياس فارق االمتصاص A2 )بفارق 3 دقائق(.

39 الكيمياء الحيوية عملي كيف تساعد أنزيمات ال LDH بتشخيص األمراض "لإلطالع" لدينا هنا صورة توضح كمية أنواع LDH الخمسة بعد فصلها بواسطة جهاز الرحالن الكهربائي مما يساعدنا على تحديد مكان اآلفات. وتكون نتائج الرحالن الكهربائي لهذه الصورة كما يأتي: الشخص األول في األعلى: نالحظ أن لديه ازدياد في النظيرين األول والثاني مما يدل على وجود احتشاء عضلة القلب. الشخص الثاني في المنتصف: هو الطبيعي. الشخص الثالث في األسفل: نالحظ أن لديه ارتفاعا في النظيرين الرابع والخامس مما يدل على وجود أمراض في الكبد والعضالت.

40 الجلسة الثامنة: معايرة البروتينات اإلجمالية في المصل proteins( )Serum total يتكون الدم من مجموعة من الخاليا )كريات الدم البيضاء كريات الدم الحمراء والصفيحات الدموية( م عل قة في وسط سائل ي دعى البالزما.(plasma) تتوزع بروتينات الدم ما بين الخاليا والبالزما )المصورة الدموية(. تضم المصورة الدموية نحو 300 نوع من البروتينات الذائبة فيها منها: مكونات الدم: األلبومين. الغلوبولينات )ألفا- 1 ألفا- 2 بيتا وغاما(. الفبرينوجين. الخاليا: )الكريات البيض والحمر والصفيحات الدموية(. البالزما: )تحوي بداخلها البروتينات الذائبة(. يمكن معايرة البروتينات في (serum) المصل أو البالزما.(plasma)

41 طريقة فصل البالزما (plasma) توضع عينة الدم في أنبوب يحوي أحد مضادات التخثر )ك الهيبارين وسيترات الصوديوم وفلوريد الصوديوم وEDTA ( مما يمنع التخثر )ألن هذه المركبات توقف أنزيمات التخثر( ويبقى البروثرومين والفبرينوجين. يتم بعد ذلك تثفيل األنبوب لتترسب الخاليا وبتقى البالزما الم راد حصول عليها في األعلى. طريقة فصل المصل (serum) يوضع الدم في أنبوب ويتم تركه حتى تتم عملية التخثر )نضعه نحو 20 دقيقة في الدرجة 37 مئوية بعد أخذه من المريض(. تجرى بعد ذلك عملية التثفيل. في هذه الحالة البروثرومين والفبرينوجين تحوال إلى الثرومين والفيبرين ولم يعودا موجودين في المصل. نتيجة: بروتينات البالزما = بروتينات المصل + الفبرينوجين والبروثرومين. كيف تحدث عملية التخثر )للفهم( 1. يتكون معقد من مواد يسمى منشط البروثرمبين Prothrombin activator في الدم يتضمن أكثر من 12 عامال مخثرا للدم وذلك استجابة لتلف الوعاء. 2. يحفز منشط البروثرمبين بتحويل البروثرمبين الى ثرومبين. 3. يعمل الثرمبين كأنزيم يحول الفبرينوجين الى خيوط الفبرين التي تصطاد الصفيحات وخاليا الدم والبالزما لتولد الجلطة.

42 طرائق فصل بروتينات البالزما هناك عدة طرائق لفصل بروتينات البالزما باالعتماد على الخصائص المختلفة لهذه البروتينات كالحجم والشحنة ومن هذه الطرائق: 1. الترسيب بتراكيز مختلفة من األمالح: كسلفات األمونيوم حيث يترسب: الفبرينوجين بتركيز من الملح مقداره 20% الغلوبولينات بتركيز من الملح مقداره 50% األلبومين بتركيز من الملح مقداره 100% 2.الرحالن الكهربائي :(Electrophoresis) الطريقة األكثر شيوعا يعتمد على تطبيق تيار كهربائي بشدة معينة على المحلول الموضوع على وسط داعم خامل كورق الترشيح أو السليلوز فتتحرك البروتينات نحو القطب الموجب أو السالب)بحسب شحنتها( وبسرعات تختلف بحسب كتلتها وحجمها. فإذا وضعنا البروتينات في وسط قلوي تتوحد شحنة البروتينات وتصبح سالبة فتتحرك جميعها إلى القطب الموجب ولكن بحسب كتلتها فقط. يتم بعد ذلك تجفيف ورقة الرحالن وإضافة الكاشف اللوني حيث تتناسب شدة كثافة اللون طردا مع كمية البروتين فتظهر البروتينات المختلفة كأشرطة ملونة على الورقة. يمكن بعد ذلك استخدام مقياس الكثافة اللونية (densitometer) لرسم مخطط الرحالن البياني وإعطاء النتائج باألرقام. يمكن بهذه الطريقة فصل بروتينات البالزما إلى األلبومين )األقل كتلة وسيكون في جهة القطب الموجب( والغلوبولينات )ألفا- 1 ألفا- 2 بيتا وغاما( إضافة إلى الفبرينوجين الذي يتوضع بين الغلوبولينات بيتا وغاما )ويمكن أال يظهر بشكل منفصل(. 3. التنبيذ الفائق والتخثير.

43 الكيمياء الحيوية عملي ما الذي سيختلف لو أجرينا الفصل لبروتينات المصل ال تظهر بروتينات الفبرينوجين والبروثرومين ألنهما تحوال إلى الفيبرين والثرومين أثناء عملية التخثر ولم يعودا موجودين في المصل. أهم وظائف بروتينات البالزما يمكن تقسيم بروتينات البالزما وظيفيا إلى مجموعتين كبيرتين هما: i. البروتينات الغير وظيفية هي بروتينات ال عمل لها في البالزما وإنما هي إما: بروتينات عابرة إلى مكان عملها كالهرمونات. أو بروتينات ذات وظائف خلوية في األنسجة التي جاءت منها كبعض األنزيمات مثل األميالز الليباز AST ALT LDH وبروتينات التخزين كالفيريتين. أو بروتينات تفرزها بشكل خاص بعض األورام )أو يزداد إفرازها في هذه األورام( وتسمى الواصمات الورمية markers).(tumour تصل البروتينات الخلوية إلى الدم بسبب التخرب الطبيعي لخاليا األنسجة عند انتهاء حياتها فتتحرر محتوياتها إلى النسيج الخاللي ومن ثم إلى الدم. عندما يزداد معدل هذا التخرب ألسباب مرضية )االلتهاب واألذية مثال ( ترتفع قيمة هذه البروتينات في البالزما مما يساعد على تشخيص تلك األمراض..ii البروتينات الوظيفية لها وظائف عامة في: الحفاظ على الضغط الحلولي للدم ومنع تسرب الماء خارج السرير الوعائي )األلبومين أهمها لماذا ألنه يشكل عامال أساسيا في منع خروج سوائل الدم من األوعية الدموية إلى أنسجة الجسم حيث أن األلبومين يسحب الماء(. المساهمة مع الخاليا في إعطاء الدم لزوجته )الغلوبولينات خاصة لماذا ألنها ذات وزن جزيئي مرتفع فتلعب دورا هاما في تحديد اللزوجة( الحفاظ على التوازن الحمضي-القلوي )فهي تعمل كدوارئ(.

44 إضافة إلى ذلك لها وظائف خاصة في البالزما مثل: الحفاظ على الضغط الحلولي تخثر الدم )عوامل التخثر والفيرينوجين(. تعمل كأنزيمات )عوامل التخثر واستيراز الكولين واألنهيدراز الكربونية(. تعمل كهرمونات )اإلريثروبوي تين(. الدفاع المناعي )الغلوبولينات المناعية بروتينات المتممة(. نقل المواد غير الذو ابة في الماء. المساهمة في االستجابة االلتهابية. المساهمة في إعطاء لزوجة الدم وظائف عامة تعمل كدوارئ تخثر الدم وظيفية أنزيمات هرمونات بروتينات البالزما الدفاع المناعي نقل المواد غير الذوابة في الماء المساهمة في االستجابة االتلهابية وظائف خاصة ال عمل لها في البالزما غير وظيفية

45 الكيمياء الحيوية عملي نقل المواد غير الذو ابة تتم هذه العملية بهدف إيصالها إلى األنسجة التي تحتاجها أو ستخزنها )الشحميات والكولسترول في البروتينات الشحمية والحموض الدهنية الحرة مع األلبومين( أو إلى موقع عملها )كالهرمونات الستيروئيدية والدرقية( أو إلى العضو الذي سيتخلص الجسم منها )كالبيليروبين غير المقترن وبعض األدوية والسموم إلى الكبد(. يسهم هذا النقل في حماية الجسم من التأثيرات الضارة للمواد المنقولة كترسبها على جدران األوعية )الشحميات غير القطبية( أو أكسدتها لمكونات الجسم وإنتاج الجذور الحرة )المعادن االنتقالية كالحديد والنحاس(. من الوظائف التي يؤديها ربط بعض المواد ببروتينات البالزما أيضا حماية هذه المواد من الضياع في البول CA( وFe والهيم والهيموغلوبين( والحفاظ على مخزون قريب يكون جاهزا عند الحاجة إليه )الهرمونات والمعادن(. أهم البروتينات الرابطة األلبومين: ينقل البيليروبين والحموض الدهنية الحرة واأليونات + Ca والستيروئيدات والهرمونات األخرى والعديد من األدوية. الغلوبولين الرابط للكورتيكوستيرويدات أو الترانسكورتين: ينقل الكورتيزول. الهابتوغلوبين: يربط الهيموغلوبين خارج الكريات ويحميه من اإلطراح في البول. البروتينات الشحمية: تنقل الشحميات. الغلوبولين الرابط للهرمونات الجنسية: ينقل التستوستيرون واإلستراديول. و T3. الرابط للتيروكسين: ينقل T4 الغلوبولين والترانسفيرين: ينقل الحديد..Cu + ينقل السيرولوبالزمين: المساهمة في االستجابة االلتهابية عبر مجموعة من بروتينات البالزما )بروتينات الطور الحاد )Acute phase proteins يزداد تركيزها خالل الحاالت االلتهابية الحادة أو بعد أنماط معينة من تخرب النسج )الرض واإلنتانات والحروق واألورام وااللتهابات المزمنة(.

46 أهم هذه البروتينات هي: البروتين المتفاعل (CRP= C-Reactive Protein) C يساهم في القضاء على بعض الجراثيم إذ يستطيع تحريض سبيل المتممة. مثبطات إنزيمات البروتياز: كمضاد التريبسين ألفا. 2 الهابتوغلوبين: يحمي الهيموغلوبين. الفبرينوجين والسيرولوبالزمين. Plasma Proteins Function: بعض الخصائص العامة لبروتينات البالزما يتم تصنيع معظم بروتينات البالزما في الكبد وهناك بعض االستثناءات التي تشمل الغلوبولينات غاما أو األضداد )من الخاليا المصورية( وبعض البروتينات التي تصنعها الخاليا البطانية )كالسيتوكينات(. جميع بروتينات البالزما تقريبا هي بروتينات سكرية واأللبومين هو االستثناء الرئيس ولسالسل قالئل السكريد وظائف متنوعة منها تحديد العمر النصفي لهذه البروتينات.

47 الكيمياء الحيوية عملي لكل بروتين بالزمي عمر نصفي مميز له في الدوران ويمكن تقدير العمر النصفي ألي بروتين بوسم البروتين النقي المعزول باليود المشع وحقن كمية معروفة منه في دم الشخص البالغ السوي ثم ت بز ل عينات بفترات زمنية مختلفة لقياس النشاط اإلشعاعي ورسم مخطط بياني لقيم النشاط اإلشعاعي مقابل الزمن ويمكن حساب العمر النصفي للبروتين من المخطط البياني. عمر النصف: هو الوقت الذي يستغرقه هبوط النشاط اإلشعاعي من القيمة العليا إلى نصفها. يعتمد رشح البروتينات في الكبيبات الكلوية على حجمها وشحتنها الكهربية ولذلك فلن يرشح الفبرينوجين والغلوبولينات في البول السوي )ألنهما ذات وزن جزيئي مرتفع(. وبالرغم من أن مسام الكبيبة الكلوية تسمح بمرور جزيئات بحجم األلبومين إال أنه ال يرشح منه عادة )بسبب شحنته السالبة حيث أنه ينافر الصفيحة القاعدية السالبة في أغشية الكبب الكلوية فيحدث تنافر واليعبر( إال كميات قليلة جدا ال يمكن كشفها باختبار التخثر )أقل من 0.1 غرام/يوم( ومع ذلك يبقى هو األكثر قابلية للرشح في الحاالت المرضية كما سيحتوي البول أيضا على كميات زهيدة من إنزيمات األميالز والليباز والتريبسين )حجمها أقل(. لماذا نعاير بروتينات البالزما تفيد معايرة البروتينات اإلجمالية بشكل عام في استقصاء وظيفة الكبد )تصنيع( والكلية )إطراح( ونشاط الخاليا المصورية )تصنيع األضداد(. هنالك حاالت خاصة يتم فيها قياس بروتينات معينة من البالزما )وليس اإلجمالية( وتفيد في تشخيص حاالت أو أمراض معينة كقياس CRP في الحاالت االلتهابية والواصمات الورمية )كالبروتين الجنيني ألفا AFP في سرطان الكبد وHCG في المشيمة )Choriocarcinoma والترانسفيرين والفيريتين في تقييم حالة الحديد في الجسم والبروثرومبين والفبرينوجين لتقييم وظيفة الثخثر وأنواع معينة من األضداد في األمراض االلتهابية واالنتانية والمناعية. القيم المرجعية لبروتينات البالزما: القيم المرجعية لبروتينات البالزما هي 6-8 غ/دل يشكل األلبومين منها نحو غ/دل أما الغلوبولينات فيبلغ تركيزها نحو غ/دل وتتراوح النسبة السوية لأللبومين على الغلوبولين (G:A) بين 1.5 و 2.5.

48 تفيد قياس هذه النسبة في استقصاء وظيفة الكبد والكلية ترتفع قيم البروتينات اإلجمالية في كل من حاالت التجفاف)إسهاالت وإقياءات شديدة( الورم النقوي العديد األمراض المناعية واإلنتانات المزمنة. تنخفض قيم البروتينات اإلجمالية في األمراض الكلوية المضيعة للبروتين سوء اإلمتصاص سوء التغذية قصور الكبد والحاالت المسببة لبيلة األلبومين.(Albuminuria) ينخفض تركيز األلبومين )وبالتالي البروتينات اإلجمالية( في حاالت: نقص تصنيعه )تنقص النسبة G:A بينما تبقى الغلوبولينات سوية وربما تزداد للمعاوضة( بسبب القصور الكبدي أو سوء التغذية أو تناذرات سوء االمتصاص. بيلة األلبومين )كالتناذر النفروزي: تزداد فيه الغلوبولينات وزيادة ضغط الدم واألمراض الكلوية التي تزيد الرشح الكبي( فقدانه من الجسم )كما في الحروق الواسعة والنزوف الشديدة( زيادة التقويض )الحم يات واإلنتانات الحادة واألذيات والرضوض وفرط نشاط الدرق( وفي الحمل )زيادة المطلوب وزيادة حجم الدم( غياب ألبومين الدم (Analbuminemia) الخلقية الناذرة )نقص النسبة.)G:A لماذا ترتفع قيم البروتينات اإلجمالية في حاالت التجفاف واالنتانات المزمنة في حاالت التجفاف ألن نسبة الماء تقل مما يؤدي لزيادة البروتينات زيادة نسبية. في اإلنتانات المزمنة والحاالت االلتهابية يتم تركيب البروتينات وخاصة المناعية منها بصورة كبيرة. لماذا تنخفض قيمة البروتينات اإلجمالية في األمراض الكلوية ألنه في األمراض الكلوية يتم طرح أو تخريب هذه البروتينات. لماذا يزداد ضغط الدم في حالة بيلة األلبومين )انخفاض تركيز األلبومين( ألن زيادة إطراح البروتينات يؤدي الرتفاع نسبي لكمية الماء وبالتالي يزداد ضغط الدم المعتمد على حجم الدم.

49 الكيمياء الحيوية عملي مبدأ المعايرة )تفاعل بيريت( تتفاعل شوارد النحاس في الوسط القلوي مع الروابط الببتيدية فترتبط كل شاردة نحاس مع 5-6 روابط ببتيدية لتشكل معقدا لونيا تتناسب شدة لونه البنفسجي مع تركيز البروتينات. يتألف كاشف بيريت من: كبريتات النحاس: مصدر شوارد النحاس. ماءات الصوديوم: وسط قلوي. يوديد البوتاسيوم: لمنع التفاعل التلقائي لمعقدات النحاس في الوسط القلوي. طرطرات الصوديوم والبوتاسيوم: لتثبيت التفاعل اللوني. مراحل العمل: 2. تحضير أنبوبين وإضافة المواد كما في الجدول التالي: عياري البروتين (35 غ/دل( المصل المادة األنبوب 0.1 مل --- العياري )الشاهد( الكاشف اللوني 5 مل 5 مل --- المجهول )المصل( 0.1 مل 3. امزج جيدا وانتظر 7 دقائق ثم اقرأ الكثافة الضوئية على طول الموجة 570 نانومتر. مالحظة: سنقوم بإعداد أنبوب المجهول فقط. الحساب: تركيز المجهول=ك م 35= غ/دل

50 هو ستيروئيد غولي وزنه الجزيني 383 غرام. الجلسة التاسعة: الكوليسترول بنسبة 1/3. الكولسترول نوعان هما: حر في الدماغ والبالزما مؤستر )باتحاده مع حمض دسم طويل السلسلة عند الكربون 7 في خاليا البشرة والبالزما بنسبة 2/3. مصادر الكولسترول نسبته %35 داخلي المنشأ: من بدءا األستيل كو أنزيم A خارجي المنشأ: من الغذاء الحيواني نسبته %75

51 الكوليسترول مادة دهنية غير ذو ابة في الماء. آلية نقله و HDL و VLDL لذلك ينتقل في الدوران محموال على البروتينات الشحمية LDL والدقائق الكيلوسية. LDL يوزع الكوليسترول على الخاليا ويسمى LDL-CH الكوليسترول الضار ألنه ينتقل إلى النسج مما يؤهب لترسب الكوليسترول على جدران األوعية الدموية وبالتالي تشكل عصيدة شريانية. HDL ينقل الزيادة في الكوليسترول من الدم وجدران األوعية ويعيدها إلى الكبد الذي يستقبله لمواد أخرى )حموض صفراوية( يسهل إطراحها من الجسم )لذلك يدعى HDL-CH بالنافع(. طليعة الهرمونات الستيروئيدية. & طليعة الفيتامين D3. & يدخل الكوليسترول في: بناء األغشية الخلوية. طليعة الحموض الصفراوية مغ/دل. بعد عمر 51 سنة حتى 225 مغ/دل يعتبر طبيعي. األهمية المجال المرجعي مغ/دل )ليس أقل من 05 مغ/دل(. 05 HDL-CH مغ/دل )ليس أكثر من 165 مغ/دل(. LDL-CH حتى 175 يجب أال تتجاوز نسبة قيمة ) 8 ( إذا تجاوزت هذه النسبة تبدأ خطورة التصلب العصيدي.

52 Amazing cholesterol animation: األهمية الطبية لقياس الكوليسترول في المصل تقدير مستوى كوليسترول المصل ومدى الخطورة في حاالت عديدة مؤهبة ألمراض القلب والتصلب العصيدي كالبدانة والسكري )أيضا تتطلب معايرة HDL-CH و LDL-CH والنسبة بينهما هي األهم(. أهم حاالت فرط الكوليسترول: والصميم.ApoB 100 LDL خلل مستقبالت الداء السكري والبدانة وتناول كميات كبيرة من الغذاء الغني بالكوليسترول )دسم حيوانية...( والغذاء الغني بالكريات والدهون المشبعة )الدهون المشبعة تحفز على زيادة VLDL وبالتالي زيادة LDL والكوليسترول في الدم(. اليرقان االنسدادي )نقص إطراح الكوليسترول وإعادة امتصاصه إلى الدوران البابي(. قصور الدرق )نقص استقالب الكوليسترول(. أهم حاالت نقص كوليسترول الدم: أمراض الكبد التي تضر بوظيفة التصنيع وال تؤثر في تصنيع الحموض الصفراوية. فرط نشاط الدرق )التيروكسين يسرع استقالب الكوليسترول(.

53 مبدأ المعايرة وفق الطريقة اللونية يقوم حمض الخل الثلجي بإذابة الكوليسترول فنضيف الكاشف اللوني )حمض الكبريت المركز مع كلور الحديد( الذي يتفاعل مع الكوليسترول ليعطي معقدا تتناسب شدة لونه األصفر مع تركيز الكوليسترول في العينة. إن إضافة حمض الكبريت المركز إلى حمض الخل الثلجي سينشر حرارة كبيرة يمكن تخفيف أثرها بزيادة مساحة سطح التفاعل وذلك باستخدام فيول في التجربة وليس أنبوب اختياري عادي. مراحل العمل: تحضير فيول لكل من الشاهد والمجهول وإضافة المواد حسب الترتيب التالي: عياري الكولسترول 5.2 مغ/دل المادة عينة المصل حمض الخل الثلجي الكاشف اللوني امزج كال من الفيولين على حدا جيدا ثم اقرأ العياري 1 مل 2.1 مل 2 مل الكثافة الضوئية على طول موجة نانومتر المجهول 5.1 مل 7 مل 2 مل الحساب: 100 تركيز المجهول = كثافة المجهول كثافة الشاهد تركيز الشاهد ما أخذ من العينة كثافة المجهول كثافة الشاهد = تركيز المجهول = كثافة المجهول كثافة الشاهد 4 )ملغ/دل(

54 الجلسة العاشرة: حمض البول تركيب حمض البول: حمض البول )2 8 6 ثالثي أوكسي البورين( هو الناتج النهائي لتقويض )هدم( النوكليوتيدات البورينية التي توجد عادة في الخلية إما حرة )مثال : ATP و )GTP أو كجزء من الحموض النووية DNA) و )RNA المرتبطة عادة بالبروتينات لتشكل البروتينات النووية. مصدر حمض البول الموجود في الدم بما أن هذه النوكليوتيدات البورينية موجودة في أية خلية نباتية أو حيوانية مما يجعل تقويض أي خلية في الجسم سواء كانت ذات مصدر داخلي او خارجي منشأ لحمض البول في الدم وبذلك يكون مصدر حمض البول في الجسم: خارجي: من أي غذاء يحوي خاليا كالكبد والكلية والقلب حيث ستهضم محتوياتها وت متص وبما ذلك البورينات. داخلي: من أية خلية ينتهي عمرها أو تتخرب أو أي حمض نووي يتقوض. وفي كلتا الحالتين يقوم الجسم وخاصة الكبد بتقويض الفائض من البورينات إلى حمض البول.

55 الكيمياء الحيوية عملي صفات حمض البول يتصف حمض البول بضعف ذوبانيته في الماء )لضعف قطبية الزمر الوظيفية فيه كالكيتون(. أما ملح حمض البول مع الصوديوم )البوالت أحادية الصوديوم( فهو أكثر ذوبانا منه. تتناسب شدة الذوبان طرد ا مع اإلماهة ودرجة PH ودرجة الحرارة مما يعني أن ذوبانه يقل في التجفاف والوسط الحمضي ودرجات الحرارة المنخفضة. وجوده في الدم وإطراحه يوجد حمض البول في الدم على شكل بوالت أحادية الصوديوم. تبلغ القيمة المرجعية لها في البالزما 2-7 ملغ/دل عند الذكور و 2-6 ملغ/دل عند اإلناث. يتم إطراح البوالت عن طريق البول (70%) والصفراء (30%) ترشح بوالت البالزما بكاملها تقريبا في الكبيبات ليعاد امتصاص معظمها في النبيبات القريبة يتم بعد ذلك إطراحها بشكل فعال في األجزاء القريبة من النبيبات البعيدة ويحدث القليل من عود االمتصاص (10%) في أجزائها البعيدة. تستطيع البالزما )في ال PH الخاصة فيها( إذابة كميات من البوالت حتى 7 ملغ/دل. أما عندما يزيد تركيزها عن ذلك فتتشبع البالزما ويبدأ تشكل بلورات البوالت التي تترسب في األنسجة والمفاصل أما في البول )PH>7.57( فيغلب حمض البول على ملحه ويمكن أن يشكل بلورات تترسب في األنابيب الكلوية.

56 التغيرات الفيزيولوجية: هناك عدة عوامل فيزيولوجية تؤثر على مستوى حمض البول في الدم كالجنس )اإلناث>الذكور بسبب الطمث( والبدانة )كثرة تخرب الخاليا( والحالة االقتصادية )نوع الغذاء( ومحتوى الغذاء )وجود الخاليا( والعامل الوراثي )ارتفاعه عند عائالت معينة(. األسباب المرضية لزيادة حمض البول في الدم فرط حمض بول الدم هو زيادة تركيزه في البالزما عن 7 ملغ/دل مما يؤدي إلى تشكل البلورات وترسبها في األنسجة بما في ذلك المفاصل فيتعامل الجسم معها كأجسام أجنبية وتبتلعها البالعات. لهذه البلورات شكال ابريا وعندما تبتلعها البالعات يتمزق جدارها فتتحرر محتوياتها بما في ذلك محتويات الجسيمات الحالة والوسائط االلتهابية ليحدث االرتكاس التهابي الموضعي )التهاب مفاصل وحيد( والعام تسمى هذه الحالة السريرية بداء النقرس.(Gout) يزداد حمض البول في الدم ألي سبب يؤدي إلى زيادة إنتاجه أو نقص إطراحه أو كليهما. تسمى هذه الزيادة )النقرس( بدئية إذا كانت العلة في األنزيمات المتعلقة بسبيل تصنيع البورينات وتقويضها أو مجهولة )10% من الحاالت( وتكون ثانوية إذا كان هناك مرض ا آخر أدى إلى فرط حمض البول.

57 األسباب البدئية لزيادة إنتاج حمض البول حدوث طفرات في جين أنزيم PRPP تؤدي إلى زيادة نشاطه أو عدم استجابته للتثبيط بالنوكليوتيدات البورينية. حدوث طفرات في جين أنزيم HGPRT تؤدي إلى نقص فعاليته أو غيابه تماما )متالزمة ليش_نيهان(. حدوث طفرات في جين أكسيداز الزانثين فتؤدي إلى زيادة فعاليته. األسباب الثانوية لفرط حمض البول كل ما يؤدي إلى زيادة دورة الخاليا وتخربها )كاألورام الخبيثة وخاصة سرطانات الدم كاالبيضاض والصدفية وغيرها(. كل ما يؤدي إلى نقص اإلطراح )ألي سبب يؤدي إلى نقص معدل الرشح الكبي كالقصور الكلوي أو منافسة حمض البول على آلية اإلطراح الفعال كالالكتات وهيدروكسي البوتيرات والمدرات التيازيدية أو تثبيطها كالجرعات المنخفضة من األسبرين(. زيادة هيدروكسي البوتيرات في المخمصة وتترافق مع التجفاف مما يؤدي إلى فرط حمض البول أيضا. مالحظة: الجرعات العالية من األسبرين وكذلك األدوية الطارحة لحمض البول تثبط عود االمتصاص في األجزاء البعيدة من النبيبات البعيدة ولذلك تستخدم في عالج فرط حمض بول الدم. الحاالت المسببة لخفض حمض البول عوز أنزيم أوكسيداز الزانثين ونازعة أمين األدينوزين. أمراض الكبد الشديدة التي تفقده وظيفته. الجرعات المفرطة عند عالج فرط حمض البول وخلل عود االمتصاص من النبيبات الكلوية. في الحالة األول ينقص حمض البول في الدم والبول ويزداد إطراح الهيبوزانثين والجوانين في البول.

58 أسئلة للنقاش لماذا تظهر األعراض في المفاصل الصغيرة المحيطية وتزداد النوب في البرد بسبب تشكيل حمض البولة لبلورات في المفاصل تهاجمها البالعات كونها جسم غريب ويسبب هذا آالما. ما الحمية الغذائية التي تنصح بها مريض النقرس حمية غذائية ناقصة البروتين بشكل يتوافق مع الحاجة. ماذا يجب ان نعطي المريض عندما نصف له األدوية الطارحة لحمض البول يعطى الماء بسبب طرح كمية أكبر من الماء عبر مدرات البول. هل تترافق حصيات حمض البول في الكلية مع زيادة إنتاج حمض البول أم نقص زيادة إنتاج حمض البول. اإلطراح الجزء العملي مبدأ المعايرة: حمض البول مادة مرجعة يمكن أكسدته في وسط قلوي )سيانيد الصوديوم( بواسطة كاشف فولن )الفسفوتنغستات( ليتحول األول إلى أالنتوئين والثاني إلى أزرق التنغستين: sodium cyanide Phosphongstate + Uric acid Tungsten blue + Allantoin وبما أن الكريات الحمر تحتوي على كميات كبيرة من مركبات السلفهيدريل التي تعطي التفاعل ذاته مع كاشف فولن نستخدم كبريتات الصوديوم لمنع تفجر الكريات الحمر في حال وجودها. وقبل ذلك كله نستخدم تنغستات الصوديوم وحمض الكبريت لترسيب البروتينات وتخريبها لتحرير أية جزيئة من حمض البول المرتبطة مع البروتينات.

59 الكيمياء الحيوية عملي مراحل العمل: انبوب العمل: 1 1 مل مصل مل كبريتات الصوديوم مل تنغستات الصوديوم مل حمض الكبريت. مزج جيد ثم التثفيل أو الترشيح )ال حاجة ألي منهما في تجربتنا ألن تركيز البروتين وعدد الكريات الحمر قليالن( أنبوبان )مجهول + شاهد(: يجب العمل بهما معا في الوقت ذاته وبترتيب المواد ذاتها: 1.المزيج 2.محلول 3.ماء 4.سيانيد 7.كاشف 3.انتظار السابق الشاهد الصوديوم فولن 2.5 مل 0.5 مل 5 دقائق --- المجهول 3 مل مل 2 مل 2.5 مل 0.5 مل الشاهد --- قراءة الكثافة عند طول الموجة 520 نانومتر. الحساب: يمكن حساب تركيز المجهول بالمعادلة التالية: تركيز المجهول = كثافة المجهول كثافة الشاهد ما أخذ من العينة = كثافة المجهول كثافة الشاهد تركيز الشاهد كثافة المجهول تركيز المجهول = 4 (ملغ/دل) كثافة الشاهد أي أن:

60